Breaking News

Đánh giá chất lượng khối tế bào gốc tự thân máu ngoại vi điều trị hỗ trợ bệnh nhân ung thư vú và ung thư buồng trứng

Nguyễn Duy Thăng1, Nguyễn Thị Hồng Hạnh1, Đồng Sĩ Sằng1,

Bùi Minh Đức1, Phan Thị Thùy Hoa1 và cộng sự

1. TT Huyết học – Truyền máu, Bệnh viện Trung ương Huế

TÓM TẮT

Hiện nay, hóa trị liệu là một trong những phương pháp điều trị có hiệu quả đối với những bệnh nhân bị ung thư vú và ung thư buồng trứng. Tuy nhiên, mặt trái của phương pháp này chính là làm suy giảm các dòng tế bào máu của bệnh nhân và có khả năng gây nguy hiểm cho bệnh nhân. Ghép tế bào gốc tự thân là phương pháp điều trị hỗ trợ khi bệnh nhân biểu hiện suy tủy sau hóa trị liệu.

Mục tiêu: Đánh giá chất lượng khối tế bào gốc máu ngoại vi trong quá trình thu thập, xử lý và sau giải đông.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: nghiên cứu mô tả cắt ngang trên 7 khối tế bào gốc thu thập từ máu ngoại vi của 7 bệnh nhân ung thư vú và ung thư buồng trứng tại bệnh viện Trung ương Huế.

Kết quả nghiên cứu: Số lượng tế bào CD34+/µl của bệnh nhân trước thu thập là: 26,57 ± 5,26/µl. Thể tích khối tế bào gốc thu được: 310,00 ± 51,29 ml; số lượng bạch cầu trong sản phẩm: 204,29 ± 73,22´109/l; số lượng bạch cầu đơn nhân: 94,69 ± 24,58K/l; Số lượng tế bào CD34+ thu được: 277,71 ± 126,04´106. Tỷ lệ tế bào CD34+ sống sau thu thập: 99%. Sau khi xử lý và bảo quản đông lạnh trong Nitơ lỏng -1960C, giải đông, tỷ lệ tế bào CD34+ sống: 77,31 ± 17,42%.

Kết luận: Khối tế bào gốc thu thập từ máu ngoại vi của 7 bệnh nhân ung thư vú và ung thư buồng trứng đạt tiêu chuẩn để ghép cho họ.

Từ khóa: Hóa trị liệu, ung thư vú và buồng trứng, tế bào gốc máu ngoại vi tự thân.

ABSTRACT

Evaluating the quality of packed autologous peripheral stem cells used for

supportive treatment in patients with breast or ovary cancer

Nguyen Duy Thang1, Nguyen Thi Hong Hanh1, Dong Si Sang1,

Bui Minh Duc1, Phan Thi Thuy Hoa1 et al

At present, chemotherapy is one of effective therapies for patients with breast or ovarian cancer. However, side effects of this treatment are to cause profound decrease of peripheral blood cells, and even lethality. Autologous stem cell transplantation is supportive treatment when patients have hematopoietic aplasia after chemotherapy.

Objective: Evaluating quality of packed autologous peripheral stem cells during collection, processing before deep-frozen storage and after thawing.

Population and Methods: this is a descriptive cross-sectional study carried out on 7 packed autologous peripheral stem cells from 7 patients with breast or ovarian cancer treated at Hue central hospital.

Results: Patient’s CD34+ cell count (µl) before collection by apheresis were 26.57 ± 5.26/µl. The mean volume of packed peripheral stem cells was 310.00 ± 51.29 ml. Leucocyte count of packed peripheral stem cells was 204.29 ± 73.22´109/l; monocyte: 94.69 ± 24.58 K/l. CD34+ cell count was 277.71 ± 126.04´106. Percentage of living CD34+ cells was 99%. After processing and frozen storage in nitrogen liquid (-1960C), the percentage of living CD34+ cell after thawing was 77.31 ± 17.42 %.

Conclusion: Packed autologous peripheral stem cells of 7 patients with breast or ovarian cancer met criteria of quality for transplanting into them.

Key words: Chemotherapy, breast or ovarian cancer, autologous peripheral stem cells.

 

 

 

  1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Cho đến nay, hóa trị liệu vẫn là phương pháp điều trị cơ bản trong bệnh lý ác tính. Tuy nhiên, độc tính của thuốc đối với cơ thể, đặc biệt là trên mô tạo máu đã là trở ngại lớn khiến các nhà lâm sàng khó sử dụng phác đồ hoá trị liều cao (liều chí mạng) nhằm tiêu diệt triệt để các tế bào ung thư [3].

Basser báo cáo tại Hiệp hội Ung thư học lâm sàng Mỹ (ASCO) 1998 về hóa trị liều cao với Epirubicin, Cyclophosphamide, Mesna, Filgastrin và ghép tế bào máu ngoại vi trên 100 bệnh nhân ung thư vú di căn hạch cho thấy tỷ lệ sống thêm không bệnh (DFS: Disease Free Survival) là 62%, tỷ lệ sống thêm toàn bộ (OS: Overall Survival) là 66% sau 48 tháng theo dõi [3].

Tế bào gốc (TBG) tạo máu tự thân có thể thu thập từ tủy xương hoặc từ máu ngoại vi. Ngày nay, nhờ các hệ thống máy tách tế bào tự động nên việc thu thập tế bào gốc chủ yếu từ máu ngoại vi vì thu thập dễ dàng, thời gian phục hồi bạch cầu và tiểu cầu nhanh do đó rút ngắn thời gian nằm viện và giảm chi phí điều trị [9].

Bình thường số lượng TBG trong máu ngoại vi rất thấp, để có đủ liều ghép người ta sử dụng yếu tố kích thích tăng sinh bạch cầu như G-CSF (Granulocyte-Colony stimulating factor), sau đó TBG sẽ được thu thập bằng máy tách tế bào tự động ví dụ máy COM.TEC [4], [5], [6], [7], [9].

Tại Việt Nam, hiện chưa có công trình nghiên cứu nào về hóa trị liều cao và ghép tế bào gốc tạo máu hỗ trợ trong điều trị ung thư vú và ung thư buồng trứng đã được công bố. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài này với mục tiêu: Đánh giá chất lượng khối tế bào gốc máu ngoại vi trong quá trình thu thập, xử lý và sau giải đông.

2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu: 07 khối tế bào gốc được thu thập từ máu ngoại vi của 7 bệnh nhân ung thư vú và ung thư buồng trứng giai đoạn muộn và tái phát được điều trị tại bệnh viện Trung ương Huế từ tháng 3/2014 đến tháng 6/2015.

2.2. Phương pháp nghiên cứu:

+ Thiết kế nghiên cứu: mô tả cắt ngang

+ Các biến số nghiên cứu

Tuổi, giới, cân nặng

Số lượng tế bào CD34+ trước khi thu thập

Thời gian thu thập tế bào gốc

Thể tích khối tế bào gốc

Thể tích khối tế bào gốc sau khi xử lý để bảo quản (giảm thiểu huyết tương)

Số lượng tế bào CD34+ trong khối tế bào gốc

Tỷ lệ tế bào CD34+ sống

Nuôi cấy tạo cụm tế bào gốc CD34+

Nuôi cấy vi khuẩn khối tế bào gốc

+ Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng

Khối tế bào gốc cần bảo đảm tiêu chuẩn: số lượng tế bào CD34+ của khối TBG cần đạt chuẩn: 2 – 2,5´106 tế bào /kg(1,2)

+ Quy trình nghiên cứu

Tổng phân tích tế bào máu hàng ngày.

Đếm số lượng tế bào CD34+ của bệnh nhân trước khi tách tế bào gốc (vào các ngày thứ 3, 4, 5… sau tiêm G-CSF [Neupogen]).

Khi số lượng tế bào CD34+ của bệnh nhân đạt > 20 tế bào/µl, tiến hành thu thập khối tế bào gốc bằng máy tách tế bào tự động COM.TEC của hãng Fresenius Kabi (Đức).

Xử lý khối tế bào gốc để bảo quản đông lạnh sâu:

Điều chỉnh mật độ tế bào từ 1 – 5´108/ml trong 100 – 120ml khối TBG.

Trong mỗi túi, trộn khoảng 20,5ml hỗn dịch TBG với dung dịch DMSO 50% theo tỷ lệ 4/1, lắc đều túi bằng máy trộn CoolMix ở 40C. Khối TBG bảo quản đông lạnh có nồng độ DMSO là 10%.

Đặt túi TBG vào 1 túi bọc chuyên dụng, hàn túi.

Đặt sản phẩm trên vào hộp bảo quản đông lạnh Canister, dán nhãn điền đầy đủ thông tin của người bệnh.

Bảo quản khối tế bào gốc:

Cho hộp Canister có chứa túi tế bào gốc vào máy hạ nhiệt theo chương trình, từ nhiệt độ phòng xuống đến -1400C, lấy hộp Canister ra và bảo quản trong hệ thống Nitơ lỏng -1960C.

Giải đông túi TBG ở nhiệt độ 370C (trước khi ghép cho bệnh nhân, tiến hành đánh giá tỷ lệ tế bào CD34+ sống, nuôi cấy vi khuẩn, nuôi cấy tạo cụm tế bào gốc tạo máu).

Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu:

Xác định các chỉ số tế bào máu bằng máy Celldyn 3200.

Đếm tế bào CD34+ bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang theo quy trình của hãng Becton Dickinson.

Xác định tỷ lệ tế bào sống bằng nhuộm xanh Trypan.

Cấy vi khuẩn bằng máy Bactec 9050.

Nuôi cấy tạo cụm tế bào gốc tạo máu với môi trường Methocult 44434 Classic.

Xử lý số liệu: bằng phương pháp thống kê y học, sử dụng phần mềm SPSS 15.0. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Đặc điểm nhóm đối tượng nghiên cứu

Bảng 1: Đặc điểm về tuổi, cân nặng của đối tượng nghiên cứu

Đặc điểm Thấp nhất Cao nhất X ± SD
Tuổi 37,00 53,00 46,29 ± 5,65
Cân nặng (kg) 46,00 57,00 52,86 ± 3,98

3.2. Đặc điểm về chỉ số tế bào máu của đối tượng nghiên cứu trước và sau khi thu thập tế bào gốc

Bảng 2: Đặc điểm chỉ số tế bào máu của bệnh nhân trước và sau thu thập tế bào gốc

Thời điểm

Tham số

 Trước thu thập Sau thu thập p1* p2**
Ngày 1 Ngày 2 Ngày 1 Ngày 2
Hồng Cầu M/μl 3,51 ± 0,57 3,29 ± 0,55 3,15 ± 0,47 2,95 ± 0,47 < 0,05 < 0,05
Bạch cầu K/μl 41,77 ± 14,77 42,84 ± 12,23 34,24 ± 14,00 33,08 ± 14,21 < 0,05 < 0,05
BC đơn nhân K/μl 7,25 ± 3,40 5,42 ± 1,33 5,33 ± 3,35 2,70 ± 0,88 < 0,05 < 0,05
Tiểu cầu K/μl 181,57 ± 59,37 122,00 ± 48,05 114,86 ± 71,80 69,86 ± 26,93 < 0,05 < 0,05

(p1*: so sánh trước và sau thu TBG ngày 1; p2**: so sánh trước và sau thu TBG ngày 2)

Nhận xét: Số lượng bạch cầu, bạch cầu đơn nhân, tiểu cầu sau khi thu TBG giảm có ý nghĩa thống kê so với trước khi thu TBG (p < 0,05).

Bảng 3: Kết quả quá trình thu thập tế bào gốc máu ngoại vi trong 2 ngày

Tham số\Thời điểm Ngày 1 Ngày 2 p
Số lượng CD 34+ trước tách tế bào/µl 25,57 ± 2,88 26,57 ± 5,26 > 0,05
Thời gian thu thập tế bào gốc (phút) 198,29 ± 39,52 181,29 ± 9,74 > 0,05
Thể tích xử lý trên máy (ml) 10655,14 ± 706,98 9897,86 ± 727,07 > 0,05
Thể tích khối tế bào gốc (ml) 310,00 ± 51,29 331,71 ± 85,045 > 0,05
Thể tích khối TBG bảo quản (ml) 106,00 ± 6,58 106,86 ± 3,39 > 0,05
Số lượng bạch cầu K/l 204,29 ± 73,22 227,00 ± 54,79 > 0,05
Số lượng bạch cầu đơn nhân K/l 94,69 ± 24,58 71,59 ± 17,67 > 0,05
Tỷ lệ CD34+ (%) 0,47 ± 0,23 0,44 ± 0,31 > 0,05
Số lượng CD 34+/µl 0,95 ± 0,53 0,97 ± 0,58 > 0,05
Tỷ lệ CD 34 + sống (%) 99 99 > 0,05
Số lượng CD 34+ (´106)/sản phẩm 277,71 ± 126,04 295,83 ± 176,06 > 0,05

Nhận xét: Thể tích khối TBG sau khi cô đặc giảm còn 1/3 thể tích khối tế bào gốc ban đầu.

Bảng 4: Số lượng tế bào của khối tế bào gốc sau khi giải đông

Ngày 1 Ngày 2 p
Tỷ lệ tế bào CD34+ sống (%) 74,81 ± 16,61 77,31 ± 17,42 > 0,05
Số lượng CD34+ sống (´106) 214,24 ± 121,72 231,04 ± 149,60 > 0,05
Liều CD34+ ghép ´106/kg 4,19 ± 2,08 4,77 ± 3,18 > 0,05

Nhận xét: trên 70% tế bào CD34+ sống sau giải đông và liều tế bào gốc CD34+ đạt trung bình theo thứ tự là 4,19 và 4,77 x106/kg.

Bảng 5: Kết quả nuôi cấy tạo cụm và cấy vi khuẩn khối tế bào gốc

Nuôi cấy Số lượng mẫu mọc Số lượng mẫu không mọc
Tạo cụm tế bào gốc 7 0
Vi khuẩn 0 7

Nhận xét: Kết quả nuôi cấy chứng tỏ 7 khối tế bào gốc thu được đạt chất lượng sống và đặc biệt không bị nhiễm khuẩn.

4. BÀN LUẬN

Bảy bệnh nhân của chúng tôi đều là nữ giới với độ tuổi trung bình là: 46,29 ± 5,65 tuổi, cân nặng là 52,86 ± 3,98 kg (Bảng 1).

Để thu thập đủ số lượng TBG tạo máu phục vụ ghép, chúng tôi đã kích thích tăng sinh bạch cầu ở bệnh nhân bằng G-CSF (Neupogen). Sau tiêm ngày thứ 3, chúng tôi tiến hành đếm số lượng CD34+ trong máu ngoại vi của bệnh nhân hàng ngày. Khi số lượng CD34+ đạt ngưỡng > 20 tế bào/µl, chúng tôi thu thập tế bào gốc. Qua thực tế, chúng tôi nhận thấy ngày có số lượng tế bào CD34+ đạt đỉnh vào khoảng ngày thứ tư hoặc thứ năm sau khi kích tủy. Kết quả này cũng tương tự kết quả của Trần Ngọc Quế [8]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành thu tế bào gốc trong 2 ngày liên tiếp nhằm đạt được liều điều trị tốt nhất cho bệnh nhân.

Số lượng tế bào CD34+ của bệnh nhân thu được (tính theo khối TBG) ở ngày thứ nhất là 277,71 ± 126,04´106, ngày thứ hai là 295,83 ± 176,06´106 (Bảng 3)

Vào cả hai ngày thu thập tế bào gốc, số lượng bạch cầu, hồng cầu, tiểu cầu của bệnh nhân sau thu thập tế bào gốc giảm có ý nghĩa thống kê so với trước khi thu tế bào gốc (Bảng 2). Tuy nhiên, chúng tôi chưa gặp tai biến nào xảy ra liên quan đến giảm các dòng tế bào máu này.

Kết quả ở bảng 3 cho thấy, vào ngày 1, thời gian thu thập tế bào gốc trung bình là 198,29 ± 39,52 phút và ngày 2 là 181,29 ± 9,74 phút. Kết quả này thấp hơn so với nghiên cứu của Vũ Hoàng, điều này có thể do chúng tôi sử dụng tĩnh mạch bẹn khi thu tế bào gốc, nên tốc độ xử lý của máy nhanh hơn(10). Thể tích khối tế bào gốc thu thập được trung bình là 310,00 ± 51,29 ml, kết quả này tương tự với kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc Quế [8]. Thể tích khối TBG sau khi xử lý của ngày 1: 106,00 ± 6,58 và ngày 2: 106,86 ± 3,39 ml, chúng tôi đã giảm thiểu phần lớn huyết tương để tối ưu việc bảo quản nhưng vẫn đảm bảo mật độ tế bào.

Số lượng tế bào CD34+/µl ngày 1 và ngày 2 lần lượt là 0,95 ± 0,53 và 0,97 ± 0,58/ µl. Tỷ lệ tế bào sống đạt 99%.

Theo bảng 4, tỷ lệ tế bào sống sau khi giải đông là 74,81 ± 16,61% và 77,31 ± 17,42%. Tỷ lệ này thấp hơn kết quả của Trần Ngọc Quế [8]. Vì trong nghiên cứu của chúng tôi có 1 mẫu khi nhuộm xanh Trypan đã không pha loãng nên tỷ lệ sống chỉ 60%.

Từ tỷ lệ tế bào sống thu được, chúng tôi tính số lượng CD34+ có trong mẫu TBG sau rã đông chia cho trọng lượng của bệnh nhân, từ đó chúng tôi có liều CD34+ dùng cho bệnh nhân. Kết quả liều trung bình TBG sử dụng để ghép cho bệnh nhân là: 4,19´106 tế bào/kg (ngày 1) và 4,77´106 tế bào/kg (ngày 2) (Bảng 4). Nếu so sánh với tiêu chuẩn để ghép: 2-2,5´106 tế bào CD34+/kg thì tất cả khối tế bào gốc chúng tôi thu thập được đều vượt liều ghép tiêu chuẩn từ 1,8 đến 2,24 lần(1,2).

Theo bảng 5, cả 7 sản phẩm khối tế bào gốc đều được nuôi cấy vi khuẩn, kết quả là 7 mẫu âm tính. Kết quả này cho thấy quy trình thu thập tế bào gốc được thực hiện trong chu trình kín bảo đảm vô trùng tốt nên đã hạn chế được tình trạng nhiễm vi khuẩn của sản phẩm tế bào gốc. Đồng thời, chúng tôi cũng đã tiến hành nuôi cấy tạo cụm tế bào gốc tạo máu, kết quả 7 mẫu tế bào gốc đều mọc tốt. Điều này chứng tỏ khối tế bào gốc thu được bảo đảm chất lượng.

Tóm lại, qua quá trình nghiên cứu từ thu thập, xử lý, bảo quản đông lạnh sâu và giải đông khối tế bào gốc, kết quả cho thấy khối tế bào gốc thu được đạt chất lượng để ghép cho bệnh nhân.

5. KẾT LUẬN

Qua nghiên cứu bước đầu 07 khối tế bào gốc được thu thập từ máu ngoại vi của 7 bệnh nhân ung thư vú và ung thư buồng trứng được điều trị tại Bệnh viện Trung ương Huế từ tháng 3/2014 đến tháng 6/2015, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:

Chất lượng khối tế bào gốc máu ngoại vi khi thu thập và xử lý

+ Thể tích trung bình khối tế bào gốc thu được là: 310ml.

+ Thể tích trung bình khối tế bào gốc cô đặc để bảo quản đông lạnh sâu: 106 ml.

+ Số lượng tế bào CD34+ thu được trung bình là: 277,71´106 tế bào.

+ Tỷ lệ tế bào CD34+ sống trung bình là: 99%.

Chất lượng khối tế bào gốc sau khi giải đông

+ Tỷ lệ CD34+ sống trung bình là 74,81 %.

+ Số lượng trung bình CD34+/kg: 4,19´106

+ Cấy vi khuẩn cho 7 mẫu: âm tính.

+ Nuôi cấy tạo cụm cho 7 mẫu: tất cả 7 mẫu đều mọc cụm tế bào CD34+.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

  1. Areman EM. and Loper K. (2009), Cellular Therapy: Principles, Methods and Regulation, the Unite States: Bethesda, MD, AABB.
  2. Dhot CPS. et al (2003), “Collection, separation, enumeration and cryopreservation of Cord blood, Haematopoietic stem cells – An Experimental Study”, MJAFI, 59, pp. 298-301.
  3. Donal A., Basser S. (2011), “High – Dose Chemotherapy With Autologous Hematopoietic Stem-Cell Transplantation in Metastatic Breast Cancer: Overview of Six Randomized Trials”, Journal of Clinical Oncology, 29(24), pp. 3224-31.
  4. Đỗ Trung Phấn, Nguyễn Quang Tùng và cs (2009), Nghiên cứu ứng dụng qui trình thu gom, xử lý và bảo quản tế bào gốc tạo máu sử dụng cho ghép đồng loài, Đề tài nghiên cứu cấp Bộ, nghiệm thu 12/2009, Hà Nội.
  5. Grubovic RM. (2014), “Collection of autologous and allogenic Hematopoietic peripheral blood stem cells -13 year experience”, Vox Sanguinis, 107(1), p. 234.
  6. Lê Xuân Hải, Nguyễn Anh Trí (2012), “Một số kinh nghiệm và quan điểm cần lưu ý khi triển khai ghép tế bào gốc tạo máu”, Một số chuyên đề, IV, tr. 363-378.
  7. Movassaghi K., Jaques G., Schmitt TA. et al (2007), “Evaluation of the COM.TEC cell separator in predicting the yield of harvested CD34+ cells”, Transfusion, 47, pp. 824-30.
  8. Trần Ngọc Quế, Lê Xuân Thịnh, Nguyễn Huy Thạch và cs (2015), “Tình hình thu thập, xử lý và lưu trữ tế bào gốc từ máu ngoại vi tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương từ 2006-3/2015”, Y Học Việt Nam, 492, tr. 319-324.
  9. Trần Văn Bé (1999), Tủy xương – máu cuống rốn, Ghép tủy xương, Nhà xuất bản Y học, Hà nội.
  10. Vũ Hoàng, Nguyễn Tuấn Tùng (2015), “Một số kết quả huy động và gạn tách tế bào gốc từ máu ngoại vi phục vụ ghép tự thân và đồng loại tại bệnh viện Bạch Mai 2013- 2014”, Y Học Việt Nam, 492, tr. 331-337.