Breaking News

Khảo sát sự hiện diện gen BCR-ABL trong điều trị bệnh bạch cầu kinh dòng hạt bằng kỹ thuật Realtime- PCR

Phạm Thị Ngọc Phương1, Nguyễn Văn Sơn1

Chế Thị Cẩm Hà2, Nguyễn Thành Nam2, Lê Hồng Phúc2

  1. TT Huyết học – Truyền máu, BVTW Huế
  2. Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Huế

 

TÓM TẮT

Để đánh giá chính xác quá trình điều trị thành công khi sử dụng thuốc, một yếu tố rất quan trọng là các xét nghiệm trước và sau khi dùng thuốc cần phải được tiến hành một cách hệ thống và chính xác. Đặc trưng di truyền của bệnh bạch cầu kinh dòng hạt là sự hiện diện nhiễm sắc thể Philadelphia (NST Ph1). Có nhiều phương pháp để xác định sự hiện diện của NST Ph1 như xét nghiệm di truyền tế bào (nhiễm sắc thể đồ, phương pháp lai tại chỗ huỳnh quang) các xét nghiêm sinh học phân tử (RT-PCR, Realtime-PCR). Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kỹ thuật Realtime-PCR để định lượng gen BCR-ABL trong điều trị bệnh bạch cầu kinh dòng hạt.

Kết quả khảo sát ở 50 người chẩn đoán mắc bệnh bạch cầu kinh dòng hạt đều có mang gen BCR-ABL trong máu ngoại vi. Trước khi sử dụng thuốc Imatinib, tỷ lệ trung bình định lượng gen BCR-ABL là 32,27% cho 50 bệnh nhân. Sau khi sử dụng thuốc, khoảng 92% bệnh nhân đáp ứng thuốc và gen BCR-ABL âm tính. Có 8% trường hợp kháng thuốc và gen BCR-ABL dương tính.

Từ khóa: Bạch cầu kinh dòng hạt, Philadelphia, Realtime – PCR

ABSTRACT

Survey on the presence of gene BCR-ABL in therapy of

chronic myeloid leukemia by the Realtime – PCR technique

Pham Thi Ngoc Phuong1, Nguyen Van Son1,

Che Thi Cam Ha2, Nguyen Thanh Nam2, Le Hong Phuc2

 

It is important that the test before and after using medicine must be done systematically and accurately. Genetic characteristic of chronic myeloid leukemia is the presence of the Philadelphia chromosome (Ph chromosome) There are many methods to determine the presence of Ph1 chromosomes such as cytogenetic test (chromosome map, hybrid approach fluorescent spot) molecular biology test (RT-PCR, real-time PCR). In this study, we used RT-PCR technique for quantifying BCR-ABL gene in the treatment of chronic myeloid leukemia.

The results showed that in 50 people diagnosed with chronic myeloid leukemia (positive BCR-ABL genes), before using the drug Imatinib, the average rate of BCR-ABL gene quantification was 32.27% for the 50 patients, after using the drug, approximately 92% of patients responded to the drug and gene BCR-ABL was negative, 8% of cases were drug-resistant, and  BCR-ABL gene was positive.

Keyword: BCR-ABL gene, chronic myeloid leukemia, therapy, RT-PCR technique.

 

  1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh bạch cầu kinh dòng hạt (Chronic Myeloid Leukemia – CML) là một bệnh ác tính của hệ tạo máu, đặc trưng bởi sự tăng sinh các tế bào dòng bạch cầu hạt, hậu quả là số lượng bạch cầu tăng cao ở tủy xương và máu ngoại vi với đủ các giai đoạn đang phát triển. Trong bệnh nhân CML có sự biến đổi nhiễm sắc thể rất đặc trưng đó là nhiễm sắc thể Philadelphia (NST Ph1), có mặt ≥ 95% bệnh nhân ở giai đoạn mạn tính. Bản chất sinh học phân tử của NST Ph1 là gen tổ hợp BCR-ABL được tạo thành do sự kết hợp của proto-oncogen ABL chuyển từ NST số 9 gắn vào một phần của gen BCR trên nhánh dài của NST số 22. Gen lai BCR-ABL này tạo nên sản phẩm là các protein p210 hoặc p190 hoặc p230 có hoạt tính tyrosine kinase mạnh. Protein này ảnh hưởng tới các con đường truyền tín hiệu trong tế bào dẫn tới hậu quả là bất thường về phân bào, ảnh hưởng tới quá trình chết theo chương trình (apoptosis) và tăng sinh tế bào. Đây là cơ chế chủ yếu được cho là gây ra bệnh CML.

Imatinib hiện là thuốc được chỉ định bước đầu trong điều trị bệnh bạch cầu mạn dòng tủy, thuốc hoạt động ức chế men BCR-ABL tyrosine kinase nên làm giảm khả năng nhân lên của tế bào gốc dòng bạch cầu hạt, đại thực bào của bệnh nhân CML và ức chế phát triển các tế bào gốc ác tính tiên phát. Thuốc kiểm soát được bệnh trong thời gian dài và có thể điều trị lành bệnh với ít tác dụng phụ [11]. Có nhiều phương pháp để phát hiện sự hiện diện của NST Ph1 như di truyền tế bào (NST đồ, FISH) kỹ thuật sinh học phân tử (PCR, RT-PCR, Realtime-PCR). Bài báo này giới thiệu một số kết quả về khảo sát sự hiện diện gen BCR-ABL  trước và sau khi điều trị bệnh bạch cầu kinh dòng hạt bằng thuốc Imatinib thông qua kỹ thuật Realtime-PCR tại bệnh viện Trung ương Huế.

  1. PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Gồm 50 bệnh nhân, từ 21 – 65 tuổi được chẩn đoán mắc bệnh bạch cầu kinh dòng hạt với nhiễm sác thể Ph1 dương tính và đang được điều trị bằng thuốc Imatinib tại Trung tâm Huyết học – Truyền máu, bệnh viên Trung ương Huế từ tháng 11/2013 đến tháng 5/2015.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1.Thiết kế nghiên cứu:  nghiên cứu tiến cứu, theo dõi dọc, cắt ngang

  • Bước 1: Tất cả những bệnh nhân đến khám có số lượng bạch cầu tăng cao, lách lớn đều được thăm khám lâm sàng, làm các xét nghiệm về huyết học, sinh hóa, PAL, tìm NST Ph1 ngay từ đầu khi chưa tham gia, định lượng BCR-ABL.
  • Bước 2: Chọn các bệnh nhân có đủ các tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh CML, sẽ bắt đầu được điều trị với Glivec.
  • Bước 3: Thu nhập số liệu, phân tích và tiến hành thực hiện:

2.2.2. Huyết tủy đồ:

  • Lấy 1ml máu ngoại vi cho vào ống nghiệm có chứa EDTA. Sau đó tiến hành phân tích các thông số tế bào máu bằng máy đếm tế bào tự động Blood Cell Counter Hema 21 của hãng NS BIOTEC.
  • Lấy mẫu tủy xương phết lên lam kính làm tiêu bản để quan sát và đánh giá tỷ lệ % các giai đoạn trung gian của dòng bạch cầu hạt.

2.2.3. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ

            Làm tiêu bản và phân tích các bất thường NST Ph1 qua xét nghiệm công thức NST trên mẫu tủy hoặc máu ngoại vi với phương pháp nhuộm băng G. Phân tích NST có thể phát hiện các bất thường NST. Xét nghiệm này được quan sát trên 20 tế bào đang phân chia ở kỳ giữa (Metaphase).

2.2.4. Xét nghiệm định lượng gene BCR-ABL

  • Nguyên tắc của kỹ thuật Realtime – PCR: Realtime – PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang [10].
  • Quy trình thực hiện: sử dụng bộ Kit Realtime BCR-ABL M-bcr Real-TM Quant. Trích ly RNA từ máu ngoại vi. Thực hiện quá trình phiên mã ngược bằng kỹ thuật Realtime – PCR. Tiến hành định lượng Realtime – PCR ở 5 nồng độ chuẩn trên máy C1000 Thermal Cycler.

2.2.5. Thống kê và xử lý số liệu: bằng phần mềm CFX manager Software.

  1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1. Phân nhóm tuổi và bệnh bạch cầu kinh dòng hạt     

Nghiên cứu được tiến hành trên 50 bệnh nhân, tuổi từ 21 đến 65 tuổi, trong đó 27 nữ chiếm tỉ lệ 54% và 23 nam chiếm tỉ lệ 46%.   Kết quả thống kê ở 50 bệnh nhân đang điều trị bệnh cho thấy nhóm có độ tuổi từ 30 -50 chiếm tỷ lệ cao nhất 68%, không có bệnh nhân nào dưới 20 tuổi và trên 70 tuổi mắc bệnh này. Điều này cho thấy những người mắc bệnh CML đa số đều đang trong độ tuổi trưởng thành và trung niên (bảng 1).

Bảng 1: Tương quan giữa độ tuổi và bệnh bạch cầu kinh dòng hạt

Độ tuổi n %
≤ 30 7/50 14
30 – 50 34/50 68
≥ 50 9/50 18

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương đối phù hợp với nghiên cứu của Phan Đình Điền và cộng sự khi khảo sát về mối tương quan giữa độ tuổi và tỷ lệ người mắc bệnh CML ở bệnh viện Chợ Rẫy – thành phố Hồ Chí Minh là người bệnh đều ở độ tuổi trưởng thành, trong đó tuổi trung niên chiếm tỷ lệ cao [1].

3.2. Huyết tủy đồ

Huyết đồ là kỹ thuật phải kiểm tra định kỳ 2 tuần/lần cho bệnh nhân trong suốt quá trình điều trị. Để xác định số lượng tế bào máu, chúng tôi đã tiến hành lấy các mẫu máu và xác định số lượng các loại tế bào máu bằng máy đếm tế bào tự động Blood Cell Counter Hema 21 của hãng NS BIOTEC. Kết quả thống kê ở 50 mẫu máu xét nghiệm để chẩn đoán lâm sàng trước khi điều trị thuốc Imatinib được trình bày ở bảng 2.

Bảng 2: Kết quả xác định số lượng tế bào máu

Chỉ số Người bình thường Bệnh nhân
Số lương hồng cầu (x1012/l) 4,0 – 5,5 3,87 ±  0,01
Số lương bạch cầu (x109/l) 4,0 – 10,0 15,34 ± 0,03
Số lương tiểu cầu (x109/l) 150 – 450 435,71 ± 0,10
Lượng huyết sắc tố (g/l) 120 – 155 98,85 ± 0,09

Kết quả thống kê về sự thay đổi số lượng tế bào hồng cầu trong máu ngoại vi của người bệnh ở biểu đồ 1 cho thấy: số lượng hồng cầu ở bệnh nhân là 3,87 x 1012 (tb/l) trong khi đó số lượng hồng cầu của người bình thường dao động từ 4 – 5,5×1012 (tb/l). Như vậy số lượng hồng cầu trung bình ở 50 bệnh nhân thấp hơn số lượng hồng cầu tối thiểu ở người bình thường

Tủy đồ là một xét nghiệm phân tích số lượng và chất lượng các tế bào tủy xương để thăm dò các chức năng tạo máu và gợi ý các nguyên nhân gây rối loạn chức năng tạo máu tại tủy xương. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thống kê và đánh giá tỷ lệ % các giai đoạn trung gian của dòng bạch cầu hạt trên 50 mẫu tiêu bản dịch tủy xương và so sánh với tủy đồ ở người bình thường (bảng 3).Kết quả phân tích cho thấy: lượng tiểu cầu, huyết sắc tố, số lượng hồng cầu trung bình của bệnh nhân giảm nhẹ. Bên cạnh đó số lượng bạch cầu trung bình tăng cao và biến động tùy theo từng trường hợp bệnh, trên tiêu bản có những bệnh nhân số lượng bạch cầu chiếm ưu thế.

Kết quả tủy đồ cho thấy sự tăng sinh quá mức tế bào tủy dòng bạch cầu hạt, có  > 90  tế bào có nhân với tất cả các giai đoạn trưởng thành với tủy bào và tiền tủy bào tăng từ ít đến nhiều tùy thuộc từng trường hợp bệnh.

Bảng 3. Các thông số về tủy đồ của người bệnh CML so với người bình thường

Tế bào Người bình thường Bệnh nhân
Blast 0 1,21 ± 0,95
Myeloblast 0 – 2 3,91 ± 0,51
Promyelocyte 0 – 3 5,48 ± 0,64
Myelocyte 5- 10 10,91 ± 0,65
Metamyelocyte 5 – 12 13,67 ± 0,69
Band (Stab) 5 – 12 14,70 ± 0,77
Segmen 20 – 40 26,64 ± 2,81
Lympho 8 – 25 6,64 ± 1,28
Plasmo 0 – 1 0,61 ± 0,15
Mono 0-2 2,00 ± 0,39
Erythrocyte 7 – 15 14,23 ± 1,28

 3.3. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ

Sự hiện diện NST Ph1 thường được phát hiện qua xét nghiệm công thức NST trên mẫu tủy hoặc máu ngoại vi. Ở tủy xương, bình thường các tế bào sinh máu vẫn liên tục tăng sinh và trưởng thành do vậy quá trình phân chia tế bào xảy ra một cách tự nhiên. Dựa vào tính chất này có thể làm tiêu bản NST tủy xương trực tiếp bằng cách ức chế phân bào ở giai đoạn kỳ giữa và phá vỡ tế bào hoặc nuôi cấy trong môi trường nhân tạo, sau đó làm tiêu bản và phân tích các bất thường NST.

Sau các kết quả về huyết tủy đồ và NST đồ ở các mẫu xét nghiệm, chúng tôi tiến hành định lượng gene BCR-ABL.

3.4. Định lượng gene BCR-ABL trước khi sử dụng thuốc Imatinib

Các bệnh nhân đều được phân tích định lượng gen tổ hợp BCR-ABL được tạo thành do sự chuyển  đoạn của ABL proto-oncogene từ NST 9 gắn vào vị trí 5’ của BCR ở nhánh dài NST 22 (q34;q11) trước khi sử dụng thuốc Imatinib.

Dựa vào kết quả định lượng gene BCR-ABL bằng kỹ thuật Realtime – PCR ở máu ngoại vi bệnh nhân, chúng tôi tiến hành đánh giá tần suất xuất hiện gene BCR-ABL ở 50 người bệnh. Kết quả cho thấy cả 50/50 bệnh nhân đều có sự hiện diện của gene BCR-ABL, trong đó có 1 bệnh nhân mang gene BCR-ABL dương tính cao nhất với tần suất xuất hiện là 77% và 1 bệnh nhân mang gene BCR-ABL dương tính thấp nhất là 1%. Tần suất xuất hiện trung bình của biểu hiện gen BCR-ABL dương tính ở 50 bệnh nhân là 33% (biểu đồ 4). Như vậy, 100% bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh bạch cầu kinh dòng hạt với tủy đồ dương tính đều có kết quả dương tính với gene BCR-ABL.

Khi khảo sát bằng kỹ thuật Realtime – PCR của các mẫu gen bệnh, bên cạnh sự hiện diện của 3 đường mẫu chuẩn còn có sự xuất hiện đường mẫu xét nghiệm, cho thấy gen bệnh BCR-ABL đã thực hiện quá trình phiên mã ngược và khuyếch đại các bản sao từ phản ứng Realtime – PCR.

Với sự xuất hiện của đường mẫu xét nghiệm cùng với 3 đường mẫu chuẩn, chứng tỏ đây là mẫu máu xét nghiệm của các bệnh nhân đang mắc bệnh bạch cầu kinh dòng hạt, bằng chứng là các tổ hợp gen BCR-ABL đã xuất hiện trong máu ngoại vi (biểu đồ 5)

3.5. Kết quả định lượng gene BCR-ABL sau khi điều trị thuốc bằng Imatinib

Dựa trên hiểu biết về cơ chế gây bệnh, các nhà nghiên cứu đã tìm ra thuốc điều trị nhắm đích Imatinib nhằm ức chế hoạt động của enzyme tyrosine kinase. Kết quả này được đánh giá là một cuộc cách mạng trong điều trị bệnh CML khi làm giảm từ 20% xuống còn 1,5% [5]. Gen tổ hợp BCR-ABL chủ yếu sẽ tạo ra một loại protein có hoạt tính tyrosine kinase là protein P210 và protein này là nguyên nhân chủ yếu gây bệnh.

Imatinib hiện là thuốc được chỉ định bước đầu trong điều trị bệnh bạch cầu mạn dòng tủy là phương pháp phù hợp nhất vì đem lại hiệu quả điều trị cao cho bệnh nhân. Thuốc được thử nghiệm lâm sàng từ năm 1998 và được chứng minh có hiệu quả đạt giảm được bệnh ở mức độ phân tử tốt hơn so với Interferon alpha kết hợp với Aracylin liều thấp [4], [6], [8].

Tương tự với kết quả trên, chúng tôi tiến hành định lượng gene BCR-ABL bằng kỹ thuật Realtime – PCR ở máu ngoại vi bệnh nhân sau khi sử dụng thuốc Imatinib. Qua phân tích kết quả ở 50 bệnh nhân cho thấy: 46 bệnh nhân là có đáp ứng, không còn sự hiện diện của gene BCR-ABL. Đồng thời đường biểu diễn ở biểu đồ 6 của mẫu xét nghiệm đã nhập lại trùng với đường đối chứng (chứng âm).

Như vậy, trong nghiên cứu này có 92% bệnh nhân sau khi được điều trị thuốc Imatinib đã không còn mắc bệnh, do tác nhân gây bệnh là các bản sao của tổ hợp gen BCR-ABL đã mất hoàn toàn. Khoảng 8% bệnh nhân không đáp ứng về mặt huyết học đồng thời kết quả định lượng Realtime – PCR sau điều trị vẫn còn tồn tại gen bệnh. Điều này cho thấy, những bệnh nhân này bị kháng Imatinib và thuốc đã không có khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào ác tính do tồn tại một số đột biến phát sinh ở vùng gen lai BCR-ABL kinase domain là đột biến T315I đã ngăn cản khả năng bám của Imatinib vào oncoprotein này [2].

Từ những kết quả thu được khi phân tích bằng kỹ thuật Realtime – PCR trước và sau điều trị thuốc Imatinib có thể khẳng định thuốc này đem lại hiệu quả bước đầu trong điều trị bệnh bạch cầu mạn dòng tủy. Khoảng 92% bệnh nhân dùng thuốc điều trị nhắm đích Imatinib – ức chế hoạt động của enzyme tyrosine kinase đã làm giảm đáng kể tỷ lệ bệnh bạch cầu kinh dòng hạt. Có 8% trường hợp bị kháng thuốc Imatinib.

3.6. Kết quả phân tích nhiễm sắc thể từ tủy xương

Phân tích NST 50 bệnh nhận, kết quả đều cho thấy sự xuất hiện của chuyển đoạn trên NST số 9 và NST số 22.

 4. KẾT LUẬN

Từ những kết quả nghiên cứu trên chúng tôi rút ra một số kết luận sau:

  • Ở bệnh nhân chưa điều trị thuốc Imatinib có kết quả dương tính trung bình của tần suất gen bệnh là 33,7%, cao nhất (77%) và thấp nhất là (1%).
  • Sau khi sử dụng thuốc Imatinib trên 50 người: 92% bệnh nhân có đáp ứng thuốc, không xuất hiện gen bệnh BCR-ABL, 8% trường hợp kháng thuốc với biểu hiện gen BCR- ABL dương tính.

 

TÀI LIỆU THAM KHẢO

  1. Phan Đình Điền, Phạm Hùng Vân, Nguyễn Thái Sơn (2009). Ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện nhiễm sắc thể Philadelphia trên bệnh nhân ung thư bạch cầu mạn tính dòng hạt, Tạp chí Khoa học Đại học Huế, 55, tr: 81-87
  2. Baccarani M et al. (2013). European LeukemiaNet recommendations for the management of chronic myeloid leukemia, Blood, 122(6), pp. 872-884
  3. Carol D. Jones, Cecilia Yeung (2003). Comprehensive Validation of a Real-Time Quantitative bcr-abl Assay for Clinical Laboratory Use, Am J ClinPathol, 120, pp. 42-48.
  4. Goldman J.M.,Melo J.V., (2001), “Targeting the BCR-ABL tyrosine kinase in Chronic myeloid leukemia”, The New England Journal of Medicine, 344, pp. 1084-1086
  5. Hehlmann R (2012), How I treat CML blast Crisis, Blood, 4, 737-747.
  6. Hochhaus AV., O’ Brien SG ., Guilhot F., Druker BJ, et al (2009), “Six-year follow-up of patients receiving imatinib for ther first-line treatmen of Chronic myeloid leukemia”, Leukemia, 23, pp. 1054-1061
  7. Leukemia by Qualitative and Quantitative RT-PCR (2006), Methods in Molecular Medicine, 125, pp. 69-92.
  8. Lichman MA.,Liesveld JT. (2006), “Chronic myelogenous leukemia and related disorders”, Williams Hematology, Seventh edition, McGraw-Hill Medical, Inc., New York, pp.1237-1268
  9. Nowel, PC and D.A Hungerford (1960), Chromosome studies on normal and Leukemic human leucocytes, J Natl Cancer Inst, 25, pp. 85-108
  10. Marin D, et al.(2005), “Monitoring patients in complete cytogenetic remission after treatment of CML in chronic phase with imatinib: pattern of residual leukaemia and prognostic  factors for cytogenetic relapse”, Leukemia, 19(4), pp. 507-512.
  11. Soverini S et al, BCR-ABL kinase domain mutation analysis in chronic myeloid leukemia patients treated with kinase domain inhibitors: recommendations from an expert panel on behalf of European LeukemiaNet, Blood, 2011, 118(5), pp.1208-1215