Nghiên cứu nồng độ Pepsinogen I, II và tỷ Pepsinogen I/II huyết thanh ở bệnh nhân viêm dạ dày mạn teo

Nguyễn Thị Lan Hương1, Hoàng Thị Thu Hương2,

Hà Nguyễn Tường Vân3, Nguyễn Minh Quang2, Hồ Văn Lang3

1. Bệnh viện Việt Nam- Cu Ba, Đồng Hới, Quảng Bình.

2. Trường Đại học Y Dược Huế; 3. Bệnh viện Trung ương Huế

 TÓM TẮT

Mục tiêu: Xác định nồng độ Pepsinogen I, II và tỷ PG I/II ở bệnh nhân viêm dạ dày mạn teo.

Đối tượng và phương pháp: nghiên cứu mô tả, cắt ngang trên 33 bệnh nhân được chẩn đoán xác định viêm dạ dày mạn teo bằng nội soi và mô bệnh học theo tiêu chuẩn Sydney và 30 người có kết quả nội soi là bình thường làm nhóm chứng. Mẫu huyết thanh được bảo quản ở <-20oC. Nồng độ Pepsinogen I, II huyết thanh được định lượng theo phương pháp ELISA trên máy ELISA tự động tại Khoa Hóa Sinh, Bệnh viện Trung ương Huế.

Kết quả: Nồng độ  Pepsinogen  I ở nhóm viêm dạ dày mạn teo là 36,11 ± 23,18 ng/mL thấp hơn của nhóm chứng là 105,67 ± 52,52 ng/mL, (p< 0,001); nồng độ Pepsinogen II ở nhóm viêm dạ dày mạn teo là 11,24 ± 6,61ng/mL thấp hơn ở nhóm chứng là 24,20 ± 22,63ng/mL, (p <0,01); tỷ lệ Pepsinogen I/II ở nhóm viêm dạ dày mạn teo là 4,21 ± 3,15 thấp hơn ở nhóm chứng là 7,46 ± 6,66 (p < 0,05). Pepsinogen (PG) I: Diện tích dưới đường cong (AUC) = 0,934 ở điểm cắt nồng độ PG I < 39,51ng/mL cho độ nhạy 75,8% (95%CI: 57,7 – 88,9) và độ đặc hiệu 100% (95%CI: 88,3 – 100,0). PG II: diện tích dưới đường cong (AUC) = 0,756 ở điểm cắt nồng độ PG II< 7,93 ng/mL cho độ nhạy 39,4% (95%CI: 27,9 – 57,9) và độ đặc hiệu 100% (95%CI: 88,3 – 100,0).Tỷ PG I/II: diện tích dưới đường cong (AUC) = 0,638 ở điểm cắt tỷ PG I/II < 4,88 cho độ nhạy 72,7%  (95%CI: 54,45 – 86,7)  và độ đặc hiệu 53,3% (95%CI: 34,3 – 71,6).  

Kết luận:  Nồng độ Pepsinogen I, II và tỷ Pepsinogen I/II ở nhóm viêm dạ dày mạn teo thấp hơn so với nhóm chứng. Trong chẩn đoán gián biệt viêm dạ dày mạn teo, Pepsinogen I có giá trị cao nhất kế đến là Pepsinogen II và tỷ Pepsinogen I/II.

Từ khóa: Pepsinogen, viêm dạ dày mạn teo

 ABSTRACT

STUDY ON THE CONCENTRATION OF PEPSINOGEN I, II AND RATIO PGI /II

IN PATIENTS WITH ATROPHY CHRONIC GASTRITIS

Nguyen Thi Lan Huong1, Hoang Thi Thu Huong2,

Ha Nguyen Tuong Van3, Nguyen Minh Quang2, Ho Van Lang3

 

Objective: Determine the concentration of pepsinogen I, II and ratio PGI /II in patients with atrophy chronic gastritis.

Subjects and methods: A cross- sectional, descriptive study on 33 patients, who were diagnosed atrophy  chronic gastritis by endoscopy and Sydney histopathology standard and on 30 normal people as control group. Serum samples were stored at <-20°C. Concentration of pepsinogen I, II serum were quantified by ELISA method by Evolis Twin Plus machine in Biochemistry Department of Hue Central Hospital.

Results: Pepsinogen I concentration in atrophy chronic gastritis group was 36.11 ± 23.18 ng/mL lower than in the control group (105.67 ± 52.52 ng/mL), (p <0.001); Pepsinogen II concentration in atrophy chronic gastritis group was 11.24 ± 6,61ng/mL lower than in control group (24.20 ± 22,63ng/mL), (p <0.01); The average ratio of pepsinogen I/II in atrophy chronic gastritis group was 4.21 ± 3.15 lower than the control group (7.46 ± 6.66), (p <0.05 ). Pepsinogen (PG) I: The area under the curve (AUC) = 0.934 point cut levels (cut off) PG I <39,51ng / mL for 75.8% sensitivity (95% CI: 57.7 to 88.9) and a specificity of 100% (95% CI: 88.3 to 100.0). PG II: the area under the curve (AUC) = 0.756 point cut levels (cut- off) PG II <7.93 ng / mL to 39.4% sensitivity (95% CI: 27.9 to 57, 9) and a specificity of 100% (95% CI: 88.3 to 100.0) .PG I / II: the area under the curve (AUC) = 0.638 at the cut point (cut-off) PG I / II <4.88 for 72.7% sensitivity (95% CI: 54.45 to 86.7) and a specificity of 53.3% (95% CI: 34.3 to 71.6).

Conclusion: The concentration of pepsinogen I, II and ratio pepsinogen I/ II in atrophy chronic gastritis group lower than normal group. In particular diagnostic atrophic chronic gastritis, pepsinogen I has the highest value, following pepsinogen I is pepsinogen II and ratio pepsinogen I/II.

Key words: pepsinogen (PG), atrophy chronic gastritis

 1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm dạ dày mạn teo được xem là tổn thương có nguy cơ cao gây ung thư dạ dày [6], [10]. Nguy cơ ung thư dạ dày tăng lên khi có viêm teo nặng vùng hang vị (gấp 18 lần so với dạ dày bình thường) và nhất là viêm teo nặng ở cả hang vị và thân vị (gấp 90 lần so với dạ dày bình thường) [3]. Pepsinogen (PG) huyết thanh không chỉ là một chất chỉ điểm sinh học quan trọng trong việc phát hiện sớm mà nó còn rất hữu ích trong việc đánh giá và tiên lượng bệnh. PG I được sản xuất từ tế bào chính và tế bào cổ tuyến ở vùng thân vị dạ dày. Còn với PG II ngoài những tế bào kể trên, nó còn được bài tiết ở tâm vị, môn vị, ở tuyến Brunner ở tá tràng [9]. Hay nói một cách khác PG II được sản xuất bởi những tế bào phân bố rộng khắp trên toàn bộ dạ dày cho đến tá tràng.

Theo nghiên cứu của Kang J. M. và cộng sự (2008) đã chỉ ra rằng ở những giai đoạn viêm teo dạ dày mạn tính hoặc loạn sản dạng ruột, là những tổn thương tiền ung thư dạ dày quan trọng thì Pepsinogen huyết thanh giảm tương ứng với độ trầm trọng của tổn thương.Mặc dù viêm teo dạ dày được chẩn đoán dựa trên nội soi sinh thiết nhưng việc chẩn đoán bệnh qua nội soi rất khó khăn ở giai đoạn sớm [9]. Theo một số nghiên cứu, phát hiện những tổn thương viêm dạ dày mạn teo, dị sản, loạn sản bằng phương pháp xét nghiệm huyết thanh cho kết quả chẩn đoán phù hợp khoảng 60 – 80% so với chẩn đoán bằng mô bệnh học [8].

Sàng lọc viêm dạ dày mạn teo bằng kỹ thuật nội soi, mô bệnh học là các kỹ thuật xâm nhập, còn xét nghiệm huyết thanh định lượng Pepsinogen có thể được thực hiện định kỳ để kiểm tra sức khỏe, được chứng minh là giải pháp tốt [7]. Ở miền Trung Việt Nam, hiện chưa có đề tài nào nghiên cứu hoàn chỉnh về vấn đề này. Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài với mục tiêu: Xác định nồng độ Pepsinogen I, II và tỷ PG I/II ở bệnh nhân viêm dạ dày mạn teo.

  1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Nhóm bệnh: 33 bệnh nhân được chẩn đoán viêm dạ dày mạn teo qua nội soi và mô bệnh học theo tiêu chuẩn Sydney tại Trung tâm Nội soi Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế từ tháng 12/2013 đến tháng 6/2014

Nhóm chứng: 30 người nhóm chứng có kết quả nội soi bình thường được kiểm tra tại khoa Nội soi bệnh viện Trung ương Huế tháng 12/ 2012

Tiêu chuẩn loại trừ:

– Bệnh nhân xuất huyết tiêu hóa, nội soi thực hiện như thăm khám cấp cứu.

– Bệnh nhân mắc các bệnh lý dạ dày, tá tràng khác ngoài viêm dạ dày mạn teo.

– Bệnh nhân không hợp tác nghiên cứu

2.2. Phương pháp nghiên cứu

– Thiết kế nghiên cứu : nghiên cứu mô tả cắt ngang có đối chứng, áp dụng chọn mẫu thuận tiện.

– Các bước thực hiện:

Sau khi được giải thích đầy đủ về lợi ích của phương pháp huyết thanh học và bệnh nhân đồng ý tham gia vào nghiên cứu, các bệnh nhân được khám lâm sàng, nội soi kiểm tra dạ dày tá tràng, gửi mẫu sinh thiết mô bệnh học và lấy 3ml máu để xét nghiệm. Máu toàn phần được lấy để ít nhất là trong vòng 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó sẽ được ly tâm để tách huyết thanh (1500 vòng trong 10 phút). Mẫu huyết thanh được bảo quản ở  < -20oC cho đến khi phân tích. Bước tiếp theo sẽ được định lượng nồng độ PG I, PG II trong huyết thanh và tính tỷ lệ PG I/PG II đối với những bệnh nhân được xác định viêm dạ dày mạn teo qua mô bệnh học. Nồng độ Pepsinogen huyết thanh được định lượng theo phương pháp ELISA trên máy Evolis Twin Plus tự động tại Khoa Hóa sinh Bệnh viện Trung ương Huế.

– Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm SPSS 19.0 và Medcal 12.0. Tính giá trị ngưỡng  (cut- off) có độ nhạy, độ đặc hiệu của tối ưu của PG I, II và tỷ PG I/II dựa trên đường cong ROC.

  1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Đặc điểm bệnh nhân viêm dạ dày mạn teo

Tuổi trung bình của bệnh nhân viêm dạ dày mạn teo là 48,85 ± 12,64, tuổi nhỏ nhất là 20, tuổi lớn nhất là 77. Tỷ lệ nam/nữ là 1,06/1.

Đánh giá mức độ viêm teo vùng hang vị trên mô bệnh học ghi nhận: Tỷ lệ viêm dạ dày mạn teo nhẹ là 54,5%, teo vừa là 39,4% và teo nặng là 6,1%.

Triệu chứng lâm sàng bệnh nhân viêm dạ dày mạn teo: Đau thượng vị, đầy bụng khó tiêu và ợ hơi là những triệu chứng thường gặp nhất của viêm dạ dày mạn teo.Nghiên cứu gồm 33 bệnh nhân trong đó có: 57,6% viêm  teo vùng hang vị; 42,4% viêm teo cả hang vị và thân vị, không có trường hợp nào teo thân vị đơn thuần.

3.2. Nồng độ Pepsinogen huyết thanh

Bảng 1. So sánh nồng độ Pepsinogen ở nhóm bệnh và nhóm chứng

Phânnhóm

Thôngsố

 Nhómbệnh

(n = 33)

 Nhómchứng

(n = 30)

 p
PGI (ng/mL) 36,11 ± 23,18 105,67 ± 52,52 < 0,001
PGII (ng/mL) 11,24 ± 6,61 24,20 ± 22,63 < 0,01
Tỷ PGI/PGII 4,21 ± 3,15 7,46 ± 6,66 < 0,05

Nồng độ pepsinogen I, II và tỷ pepsinogen I/II ở nhóm bệnh nhân viêm dạ dày mạn teo đều thấp hơn nhóm chứng có ý nghĩa thống kê.

 

       – Đối với pepsinogen I:  Diện tích dưới đường cong (AUC) = 0,934 ở điểm cắt nồng độ (cut-off) PG I < 39,51ng/mL cho độ nhạy 75,8% và độ đặc hiệu 100% (biểu đồ 3).

–  Đối với pepsinogen II:  diện tích dưới đường cong (AUC) = 0,756 ở điểm cắt nồng độ (cut-off) PG II< 7,93 ng/mL cho độ nhạy 39,4% và độ đặc hiệu 100% (biểu đồ 4).

–  Đối với tỷ pepsinogen I/ II:  diện tích dưới đường cong (AUC) = 0,638 ở điểm cắt (cut-off) tỷ PG I/II < 4,88 cho độ nhạy 72,7% và độ đặc hiệu 53,3% (biểu đồ 5).

  1. BÀN LUẬN

4.1. Đặc điểm bệnh nhân viêm dạ dày mạn teo

Theo nghiên cứu này, tuổi trung bình của bệnh nhân viêm dạ dày mạn teo (VDDMT)  là 48,85 ± 12,64, tuổi nhỏ nhất là 20, tuổi lớn nhất là 77. Kết quả này khá tương đương với các kết quả của các tác giả trong và ngoài nước. Nghiên cứu của Trần Khánh Hoàn và cộng sự (2006), tuổi trung bình của bệnh nhân viêm dạ dày mạn teo là 46,59±13,2 [2].

Nghiên cứu gồm 33 bệnh nhân được chẩn đoán xác định qua mô bệnh học VDDMT, trong đó bao gồm 17 nam chiếm tỷ lệ 51,5% và 16 nữ chiếm 48,5%, tỷ lệ nam/nữ là 1,06.Theo nghiên cứu của Trần Khánh Hoàn, tỷ lệ  nam/nữ là 1,64, viêm dạ dày mạn ở nam cao hơn nữ (62,2% so với 37,8%), nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê [2].

Theo y văn, triệu chứng lâm sàng của VDDMT thường nghèo nàn và không đặc hiệu. Vì vậy đa số bệnh nhân chỉ đi nội soi khi có triệu chứng hoặc biến chứng ảnh hưởng đến cuộc sống hàng ngày. Triệu chứng lâm sàng thường gặp nhất ở bệnh nhân là đau bụng vùng thượng vị chiếm 75,8%. Đây cũng chính là triệu chứng chủ yếu khiến bệnh nhân đi khám bệnh. Các triệu chứng khác như đầy bụng khó tiêu kéo dài chiếm 51,5%, ợ hơi chiếm tỷ lệ 36,4%,  buồn nôn, nôn chiếm 27,3%, nóng rát chiếm 24,2% (biểu đồ 1). Nóng rát, buồn nôn, ợ hơi chiếm tỷ lệ ít hơn và là các triệu chứng không điển hình do đó ít được bệnh nhân để ý để đi kiểm tra.

Theo Nguyễn Văn Oai, đau thượng vị hay gặp nhất (90%), tiếp đó là dấu hiệu ợ hơi, ợ chua gặp nhiều với tỷ lệ 78,4%, một số triệu chứng khác ít gặp hơn [4]. Mặc dù có khác nhau về con số cụ thể nhưng kết quả của chúng tôi vẫn tương tự các nghiên cứu nêu trên về triệu chứng đáng chú ý và thường gặp là đau thượng vị và đầy bụng khó tiêu.

Viêm dạ dày mạn teo là bệnh khá phổ biến ở nước ta và trên thế giới. Mô bệnh học là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán VDDMT. Phân độ VDDMT có nhiều cách, mới đây nhất là phân loại OLGA, mặc dù có giá trị  trong tiên lượng ung thư nhưng cần sinh thiết tới 5 mảnh tách rời làm 5 lần xét nghiệm mô bệnh học nên chưa áp dụng thực tế được. Trong nghiên cứu này chúng tôi vẫn sử dụng phân loại phổ biến hiện nay là phân loại Sydney.

Nghiên cứu cho thấy VDDMT mức độ nhẹ chiếm 54,5%, mức độ vừa chiếm 39,4% và nặng chiếm 6,1% (biểu đồ 2). Kết quả của chúng tôi phù hợp với các tác giả trong nước: VDDMT chủ yếu gặp ở hang vị, tỷ lệ viêm teo thân vị đơn thuần rất thấp và do vậy tỷ lệ viêm teo nặng ở thân vị cũng thấp. Theo Trần Khánh Hoàn (2008) viêm dạ dày mạn teo chỉ có mức độ nhẹ (54,95%) và vừa (13,52%), viêm teo chủ yếu ở hang vị [2].

4.2. Nồng độ Pepsinogen huyết thanh

Nồng độ  Pepsinogen  I ở nhóm viêm dạ dày mạn teo là 36,11 ± 23,18 ng/mL thấp hơn của nhóm chứng là 105,67 ± 52,52 ng/mL, (p< 0,001); nồng độ Pepsinogen II ở nhóm viêm dạ dày mạn teo là 11,24 ± 6,61ng/mL thấp hơn ở nhóm chứng là 24,20 ± 22,63ng/mL, (p <0,01); trị trung bình tỷ lệ Pepsinogen I/II ở nhóm viêm dạ dày mạn teo là 4,21 ± 3,15 ng/mL thấp hơn ở nhóm chứng là 7,46 ± 6,66 ng/mL, (p < 0,05) (bảng 1).

Theo nghiên cứu của Trần Khánh Hoàn, nồng độ PG I, PG II không có sự khác biệt ở bệnh nhân viêm dạ dày teo hang vị và hang vị – thân vị so với bệnh nhân không teo (p>0,05). Tuy nhiên, theo tác giả này tỷ PGI/PG II là 8,37 ± 3,46 ở nhóm teo hang vị và 7,58 ± 3,35 ở nhóm teo hang vị- thân vị thấp hơn so với nhóm VDDM không teo (10,44 ± 5,16) có ý nghĩa thống kê (p<0,05) [2] tương tự như nghiên cứu của chúng tôi.

Diện tích dưới đường cong (AUC) = 0,934 ở điểm cắt nồng độ PG I < 39,51ng/mL cho độ nhạy 75,8% và độ đặc hiệu 100% (biểu đồ 3). Như vậy, có thể đánh giá rằng mức độ chính xác của xét nghiệm PG I này là rất tốt thông qua diện tích dưới đường cong ROC >0,9. Đối với một số tác giả Nhật Bản đã chọn điểm cắt PG I ≤ 70ng/mL là điểm cắt của VDDMT nguy cơ của UTDD, theo Cao Q. (Trung Quốc) điểm cắt PG I đối với bệnh nhân VDDMT là (82,3 ng/mL) [5] cũng cao hơn của chúng tôi. Sỡ dĩ có sự khác nhau của nồng độ PG I như vậy có thể do vị trí tổn thương, đa phần bệnh nhân của chúng tôi có tổn thương hang vị không phải là thân vị như nhiều tác giả nước ngoài nghiên cứu. Nồng độ PG I cũng thay đổi theo mức độ của VDDMT cũng như độ sâu vùng tổn thương.

Đối với PGII: diện tích dưới đường cong (AUC) =0,756 ở điểm cắt nồng độ PG II< 7,93 ng/mL cho độ nhạy 39,4% và độ đặc hiệu 100% (biểu đồ 4). Như vậy với diện tích dưới đường cong 0,756 (>0,7), PG II là thông số có ý nghĩa trong chẩn đoán VDDMT.

Đối với tỷ PG I/ II: diện tích dưới đường cong (AUC) = 0,638 ở điểm cắt tỷ PG I/II < 4,88 cho độ nhạy 72,7% và độ đặc hiệu 53,3% (biểu đồ 5).

Theo nghiên cứu của Hồ Đăng Quý Dũng và cộng sự, có sự khác biệt có ý nghĩa về tỷ PG I/II ở hai nhóm bệnh nhân có hay không có viêm teo niêm mạc dạ dày (5,1± 1,8 và 6,2 ±1,4; p< 0,001). Với giá trị ngưỡng PG I/II ≤ 5,5 cho độ nhạy, độ đặc hiệu trong chẩn đoán viêm teo lần lượt là 80,7% và 76,3 % [1].

Theo Cao Q và cộng sự cho rằng PG I và tỷ PG I/II giảm có ý nghĩa ở cả bệnh nhân VTDD và UTDD (p<0,01), điểm cắt PG I ở bệnh nhân VDDMT là 82,3 ng/mL và tỷ PG I/ II là 6,05 cao hơn nghiên cứu của chúng tôi [5]. Theo tác giả này thì PG I và tỷ PG I/ PG II giảm ở bệnh nhân viêm teo thân vị có gastrin-17 tăng và tỷ này cũng giảm ở nhóm UTDD.

Như vậy, theo kết quả đường cong ROC của chúng tôi, trong chẩn đoán xác định viêm dạ dày mạn teo thì PGI có giá trị cao nhất (biểu đồ 5), điều này có khác biệt với một số tác giả như Trần Khánh Hoàn cho rằng tỷ PG I/PG II là giá trị nhất đối với bệnh nhân VDDMT hoặc một số tác giả nước ngoài khác.

  1. KẾT LUẬN

Những kết quả nghiên cứu trên cho phép rút ra một số kết luận sau:

– Nồng độ Pepsinogen I, II và tỷ Pepsinogen I/II ở nhóm viêm dạ dày mạn teo thấp hơn so với nhóm bình thường. (p< 0,05)

– Trong chẩn đoán viêm dạ dày mạn teo thì PG I có giá trị cao nhất.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

  1. Hồ Đăng Quý Dũng, Trần Đình Trí, Hoàng Hoa Hải và cộng sự (2012), “Nghiên cứu mối liên quan nồng độ Pepsinogen, gastrin huyết thanh và tổn thương mô bệnh học viêm dạ dày mạn”, Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, 16(2), tr. 178 – 183.
  2. Trần Khánh Hoàn (2008), Nghiên cứu kháng thể kháng Helicobacter pylori, nồng độ Pepsinogen, gastrin -17 và mối liên quan của chúng với viêm dạ dày mạn, Luận án Tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội.
  3. Tạ Long (2007), “Viêmdạdàymạn”, Tạp chí Khoa học Tiêu hóa Việt Nam, 2(6), tr. 329 – 338.
  4. Nguyễn Văn Oai, Nguyễn Văn Thịnh, Tô Công (2004), “Đặc điểm nội soi, mô bệnh học và mối tương quan dị sản ruột, loạn sản, HP trong viêm dạ dày mạn”, Tạp chí Y học thực hành, 1(471), tr. 63-64.
  5. Cao Q., Ran Z.H., Xiao S.D. (2007), “Screening of atrophic gastritis and gastrin cancer by serum pepsinogen, gastrin – 17 anh Helicobacter pylori immunoglobulin G antibodies”, J Dig Dis, 8(1), pp. 15 – 22.
  6. Dinis- Ribeiro M., Areia M., et al. (2012), “Management of precancerous conditions and lesion in the stomach (MAPS): guideline from the European Society of Gastrointestinal Endoscopy (ESGE), European Helicobacter Study of Gastrointestinal Endoscopy (ESGE), European Helicobacter Study Group (EHSG), and the scociedade Portuguesa de EndoscopiaDigestiva (SPED)”, Endoscopy, 44(1), pp. 74 – 94.
  7. Dinis- Ribeiro M., Yamaki G, Miki K., et al. (2004), “Meta-analysis on the validity of pepsinogen test for the gastric carcinoma, dysplasia or chronic atrophic gastritis screening”, J Med Screen, 11, pp.141- 147.
  8. Ebule I.A., Longdoh A.N., Paloheimo I.L., (2013), “Helicobacter pylori infection and atrophic gastritis”, African Health Sciences, 13(1), pp.112-117.
  9. Kim N., Jung H.C. (2010), “The Role of serum Pepsinogen in the Detection of Gastric cancer”, Gut and Liver, 4(3), pp. 307- 319.
  10. Namekata T., Miki K., Kimmey M., et al (2000), “Chronic atrophic gastritis and helicobacter pylori infection among Japanese Americans in Seattle”, American Journal of Epidermiology, 151(8), pp.820–830.