Breaking News

Phát hiện những chất chỉ điểm Phosphoprotein niệu trong theo dõi ung thư bàng quang

Nguyễn Hồng Thùy1, Phù Thị Hoa1, Antonella Pantaleo2

1. Trường Đại học Y Dược Huế

2. Đại học Sassari – Ý

 TÓM TẮT

Sự thay đổi protein phosphoryl hóa được biết là đóng vai trò quan trọng trong nhiều loại ung thư. Đối với nghiên cứu này, chúng tôi thiết lập một phương pháp mới trong nghiên cứu về protein để phát hiện những thay đổi trong thành phần phosphoprotein niệu từ bệnh nhân theo dõi ung thư bàng quang.

Mục tiêu: Đánh giá giá trị của phosphoprotein niệu trong chẩn đoán sớm và theo dõi ung thư bàng quang.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trên 82 bệnh nhân theo dõi ung thư bàng quang và 67 người tình nguyện khỏe mạnh làm nhóm chứng. Nước tiểu thu thập từ hai đối tượng trên được làm giàu phosphoproteins bằng sắc ký ái lực cố định ion kim loại (IMAC). Sau đó, phosphoproteins được phát hiện và đo bằng Dot blot.

Kết quả: Mức độ Phosphoprotein niệu của bệnh nhân theo dõi ung thư bàng quang có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p<0.05) (trung bình 33417 ± 32734 Intensity vs 23625 ± 9926 Intensity).  Kết quả sau khi phân tích cho thấy thử nghiệm có giá trị tiên đoán dương tính (PPV) và giá trị tiên đoán âm tính (NPV) lần lượt là 75% và 94,2%.

Kết luận: Chúng tôi đã tối ưu hóa phương pháp đo nồng độ phosphoprotein  niệu ở bệnh nhân theo dõi ung thư bàng quang. Bằng phương pháp Dot blot, đậm độ (Intensity) của phosphoprotein niệu ở nhóm theo dõi ung thư bàng quang cao hơn nhóm chứng. Giá trị tiên đoán dương tính và âm tính của thử nghiệm lần lượt 75% và 94,2%.

Từ khóa: phosphoprotein niệu, ung thư bàng quang

ABSTRACT

DETECTION OF PHOSPHO-PROTEIN URINARY MARKERS

FOR THE FOLLOW-UP OF THE BLADDER CANCER

Nguyen Hong Thuy1, Phu Thi Hoa1, Antonella Pantaleo2

          The changes of protein phosphorylation is known to play an important role in several cancers. In this study, we set up new method in proteomics to found out the changes in phosphoprotein composition in urine from follow up bladder cancer patients

Objectives: to evaluate the value of phosphoprotein composition in urine in the early diagnosis and surveillance of bladder cancer.

Materials and Methods: Enrolled in this study were 82 patients and 67 healthy volunteers. All patients and volunteers provided a urine sample. Urine samples were enriched phosphoproteins by using Metal Ion Affinity Chromatography (IMAC). Then, Phosphoproteins were detected and measured by Dot blot.

Results: Urinary phosphorylation (UPY) levels showed a significant difference (p=0.01) between the follow – up of the bladder cancer patients vs healthy controls (means: 33417 ± 32734 Intensity vs 23625 ± 9926 Intensity), corresponding to an approximately 2-fold increase of UPY. Analyzing the results, we found out that the test has positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) is 75% and 94.2% respective.

Conclusions: We have optimized a methodology for the measurement of urinary phosphoprotein levels in urine samples of the follow – up of the bladder cancer patients. Urine phosphoproteins Intensity of the patients was higher than the one of healthy controls (by Dot blot method). The positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) is 75% and 94.2%, respectively.

Key words: phosphoprotein composition in urine, bladder cancer

 

  1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư bàng quang (UTBQ) là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến nhất trên toàn thế giới với tỷ lệ mắc bệnh hàng năm lên tới 350.000 trường hợp. Trong các bệnh ung thư đường tiết niệu, ung thư bàng quang đứng thứ hai chỉ sau ung thư tuyến tiền liệt. Tại Hoa Kỳ, ung thư bàng quang là loại ung thư phổ biến thứ tư ở nam giới và thứ chín ở phụ nữ, với ước tính số trường hợp mới và tử vong trong năm 2014 tương ứng là 74.690 (56.390 nam; 18.300 phụ nữ) và 15.580 (11.170 nam; 4410 phụ nữ) [7]. UTBQ gây sự chú ý với cả các bác sĩ lâm sàng  và các nhà nghiên cứu ung thư bởi tỷ lệ tái phát và tử vong [2], [7].

Các yếu tố nguy cơ của UTBQ bao gồm hút thuốc lá, nghề nghiệp, tuổi, chủng tộc, giới tính…Trong đó hút thuốc lá là yếu tố quan trọng nhất, nó gây ra khoảng 50% số trường hợp ung thư bàng quang ở cả nam và nữ [3], [5].

Hiện nay, phương pháp chẩn đoán có độ nhạy cao nhất là nội soi bàng quang nhưng đây là xét nghiệm đắt tiền, xâm lấn và không phù hợp cho các chương trình sàng lọc [8], [9]. Xét nghiệm tế bào học nước tiểu là xét nghiệm không xâm lấn duy nhất thường được sử dụng trong lâm sàng. Tuy nhiên, phương pháp này cũng có nhiều hạn chế như phụ thuộc vào chủ quan người đọc và độ nhạy thấp, đặc biệt là ở các khối u có độ biệt hóa tốt [4].

Gần đây, nhiều xét nghiệm không xâm lấn trong  nước tiểu đã được phát triển trong chẩn đoán ung thư bàng quang. Một số đã được sự chấp thuận của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) để chẩn đoán và theo dõi bệnh ung thư bàng quang như BTA stat®, BTA TRAK®, NMP22, và UroVysion ™ , nhưng không có kỹ thuật nào đủ độ nhạy để thay thế nội soi bàng quang – tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán UTBQ [2], [8]. Như vậy việc tìm kiếm chất chỉ điểm sinh học nhạy và đặc hiệu cao cho theo dõi ung thư bàng quang là vấn đề cấp thiết [1].

Phosphoryl hóa tyrosine là một ngẫu biến protein hậu dịch mã quan trọng liên quan đến kiểm soát sự tăng trưởng và phát triển tế bào trong ung thư. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự phosphoryl hóa bất thường của protein là đặc điểm chung của tế bào ung thư như bệnh bạch cầu mãn tính dòng tủy, các khối u mô đệm đường tiêu hóa, các bệnh ung thư khác nhau, cũng như các rối loạn lành tính [6].

Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành thiết lập phương pháp mới trong nghiên cứu về protein để tìm ra những thay đổi trong thành phần phosphoprotein niệu từ bệnh nhân theo dõi ung thư bàng quang và đánh giá giá trị của nó trong chẩn đoán sớm và theo dõi sự tái phát của ung thư bàng quang.

Đề tài của chúng tôi có hai mục tiêu:
1. Xác định cường độ tín hiệu hóa phát quang (Intensity) của phosphoprotein  niệu của nhóm  bệnh nhân theo dõi ung thư bàng quang so sánh với nhóm chứng.
2. Đánh giá giá trị của phosphoprotein bất thường trong theo dõi ung thư bàng quang.

  1. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên mẫu nước tiểu của 149 người, bao gồm:

– Nhóm bệnh: 82 người được theo dõi ung thư bàng quang được lấy mẫu trong năm 2013, 2014

– Nhóm chứng: 67 tình nguyện viên khỏe mạnh lấy mẫu vào năm 2014 (sau khi được phỏng vấn để loại trừ các bệnh lý về đường tiết niệu).

2.2.Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả, cắt ngang

–  Mẫu nước tiểu được lấy là nước tiểu buổi sáng trong ống vô trùng và xử lý trong vòng 2 giờ sau lấy mẫu.

– Làm giàu phosphoproteins trong mẫu bằng sắc ký ái lực cố định ion kim loại (IMAC).

– Phát hiện và đo phosphoproteins bằng Dot blot.

– Xử lý số liệu bằng phần mềm MedCalc phiên bản 11.3.3

  1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

Nghiên cứu được thực hiện trên mẫu nước tiểu của 149 người, bao gồm một nhóm 82 bệnh nhân theo dõi ung thư bàng quang được lấy mẫu trong năm 2013, 2014  với tổng số 68 nam giới (83%) và 14 nữ (17 %), với độ tuổi trung bình 58,5 tuổi; và một nhóm chứng gồm 67 tình nguyện viên khỏe mạnh lấy mẫu vào năm 2014 (sau khi được phỏng vấn để loại trừ các bệnh lý về đường tiết niệu) gồm 36 nam (54%) và 31 nữ (46%) với tuổi trung bình là 41 tuổi.

3.1. Cường độ tín hiệu hóa phát quang (Intensity) của phosphoprotein  niệu của nhóm  bệnh nhân theo dõi ung thư bàng quang so sánh với nhóm chứng

Nước tiểu sau khi thu thập được làm giàu phosphoproteins bằng sắc ký ái lực cố định ion kim loại (IMAC). Sau đó, phosphoproteins được phát hiện và đo bằng Dot blot. Cường độ tín hiệu hóa phát quang (Intensity) được định lượng và phân tích với chương trình ImageJ (phiên bản 1.49) được hiển thị trong hình 1 (a) và (b).

Sử dụng phần mềm MedCalc phiên bản 11.3.3, chúng tôi thiết lập giá trị cường độ tín hiệu (Intensity) 42000 là ngưỡng cho các mẫu dương tính.

Trong hình 2,  đối với nhóm chứng, trong 67 mẫu có 62 mẫu có giá trị dưới 42000 và 5 mẫu có giá trị cao hơn ngưỡng thành lập.

Bảng 1. Phân bố số lượng bệnh nhân trong mỗi nhóm dựa trên cường độ tín hiệu.

Cường độ tín hiệu (Intensity) Nhóm chứng Nhóm bệnh
Được chẩn đoán UTBQ Theo dõi UTBQ
≥ 42000 5 20 0
< 42000 62 50 12

Đối với nhóm bệnh, trong  82 mẫu, có 70 bệnh nhân đã được chẩn đoán ung thư bàng quang, 12 người theo dõi ung thư bàng quang.

Dữ liệu trên 70 bệnh nhân ung thư bàng quang bao gồm 24 người mới được chẩn đoán và 46 người là tái phát. Trong những bệnh nhân này, có 20 mẫu với giá trị lớn hơn 42000. Dựa vào mô học, 20 mẫu này được phân thành các loại sau:
+ 3 mẫu là ung thư biểu mô tế bào chuyển tiếp xâm lấn cơ mức độ cao.
+ 1 viêm.
+ 16 ung thư biểu mô tế bào chuyển tiếp không xâm lấn cơ. (9 mẫu ở mức độ nhẹ và nặng, 7 mẫu là ung thư tại chỗ (carcinoma in situ)).
Trong 50 bệnh nhân còn lại có giá trị nhỏ hơn 42000, căn cứ vào mô học, họ được phân thành các loại sau:
+ 1 ung thư bàng quang xâm lấn cơ mức độ cao.
+ 34 ung thư bàng quang không xâm lấn cơ (bao gồm 3 ở mức độ cao và 31 mức độ thấp).
+ 15 viêm.

Dữ liệu về 12 mẫu theo dõi ung thư bàng quang gồm 7 bệnh nhân với ung thư tuyến tiền liệt, 4 với tiền sử ung thư biểu mô tế bào chuyển tiếp và 1 bệnh nhân là quá sản lành tính tuyến tiền liệt, tất cả đều có giá trị nhỏ hơn 42000.

Bảng 2. Phân nhóm số lượng bệnh nhân trong nhóm bệnh căn cứ vào mô học và Intensity

Cường độ tín hiệu

Intensity

 Viêm K.  biểu mô tế bào chuyển tiếp xâm lấn cơ mức độ cao K.  biểu mô tế bào chuyển tiếp không xâm lấn cơ
  ≥ 42000 1 3 16
< 42000 15 1 34

 3.2.  Đánh giá giá trị của phosphoprotein bất thường trong theo dõi ung thư bàng quang.

Trên thực tế, 12 trong số 16 bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào chuyển tiếp không xâm lấn cơ với kết quả > 42000 có tái phát trong vòng 12 tháng (trung bình: 7 tháng) với giá trị tiên đoán dương là 75% (PPV). Các PPV sau 2 năm sẽ có trong năm 2015.
Mặt khác, 2 trong số 34 bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào chuyển tiếp không xâm lấn cơ với giá trị < 42000 có tái phát trong vòng 12 tháng với giá trị tiên đoán âm tính (NPV) là 94,2%. NPV sau 2 năm sẽ có trong năm 2015.
Mức độ tái phát của những bệnh nhân có kết quả > 42000 trung bình là 7 tháng. Nguy cơ tái phát trong vòng 12 tháng là cao hơn 13 lần ở những bệnh nhân với kết quả >42000 so với bệnh nhân  kết quả <42000.

Thử nghiệm dương tính tương quan với lý thuyết nguy cơ tái phát theo Genito-Urinary Cancer Group (GUCG) (36% vs 28%)

Mức độ Phosphoprotein niệu của bệnh nhân theo dõi ung thư bàng quang có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p<0.05) (trung bình 33417 ± 32734 Intensity vs 23625 ± 9926 Intensity).  Kết quả sau khi phân tích cho thấy thử nghiệm có giá trị tiên đoán dương tính (PPV) và giá trị tiên đoán âm tính (NPV) lần lượt là 75% và 94,2%. Kết quả sơ bộ này đã xác nhận chất lượng chẩn đoán của phosphoproteins niệu như là chất chỉ điểm cho ung thư bàng quang.

Ở nhóm chứng, sự khác biệt về tuổi tác hay tình trạng sinh lý có thể là nguyên nhân ảnh hưởng đến kết quả.

Việc tính toán độ nhạy và độ đặc hiệu trong nghiên cứu của chúng tôi có những hạn chế bởi  các trường hợp âm tính thực và các trường hợp dương tính thật không thể phân biệt một cách chính xác và xác định ở những bệnh nhân theo dõi tái phát.

Tuy nhiên, cần thiết phải nghiên cứu và đánh giá thêm trên số lượng mẫu lớn hơn để thiết lập giá trị chẩn đoán của phosphoprotein niệu.

  1. KẾT LUẬN

– Mức độ Phosphoprotein niệu của bệnh nhân theo dõi ung thư bàng quang có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p<0.05) (trung bình 33417 ± 32734 Intensity vs 23625 ± 9926 Intensity).

– Kết quả sau khi phân tích cho thấy thử nghiệm có giá trị tiên đoán dương tính (PPV) và giá trị tiên đoán âm tính (NPV) lần lượt là 75% và 94,2%.

Kết quả sơ bộ này đã xác nhận chất lượng chẩn đoán của phosphoproteins niệu như là chất chỉ điểm cho ung thư bàng quang.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.Budman L. I., Kassouf W., & Steinberg J. R. (2008), Biomarkers for detection and surveillance of bladder cancer, Can Urol Assoc J, 2(3), pp. 212-221.

2.Ghafouri-Fard S., Nekoohesh L., & Motevaseli E. (2014), Bladder cancer biomarkers: review and update, Asian Pac J Cancer Prev, 15(6), pp. 2395-2403.

3.Kiriluk K. J., Prasad S. M., Patel A. R., Steinberg G. D., & Smith N. D. (2012), Bladder cancer risk from occupational and environmental exposures, Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 30(2), pp. 199-211. doi: 10.1016/j.urolonc.2011.10.010

4.Kirkali Z., Chan T., Manoharan M., Algaba F., Busch C., Cheng L., Kiemeney L., Kriegmair M., Montironi R., Murphy W. M., Sesterhenn I. A., Tachibana M., & Weider J. (2005), Bladder cancer: Epidemiology, staging and grading, and diagnosis. Urology, 66(6), pp. 4-34. doi: 10.1016/j.urology.2005.07.062

5.Roobol M. J., Bangma C. H., el Bouazzaoui S., Franken-Raab C. G., & Zwarthoff E. C. (2010), Feasibility study of screening for bladder cancer with urinary molecular markers (the BLU-P project), Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 28(6), pp. 686-690. doi: 10.1016/j.urolonc.2009.12.002

6.Shchemelinin I., Sefc L., & Necas E. (2006), Protein kinases, their function and implication in cancer and other diseases, Folia Biol (Praha), 52(3), pp. 81-100.

7.Siegel R., Ma J., Zou Z., & Jemal A. (2014), Cancer statistics, 2014. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 64(1), pp. 9-29. doi: 10.3322/caac.21208

8.Van Rhijn B. W. G., van der Poel H. G., & van der Kwast T. H. (2009), Cytology and Urinary Markers for the Diagnosis of Bladder Cancer, European Urology Supplements, 8(7), pp. 536-541. doi: 10.1016/j.eursup.2009.06.008

9.Vriesema J. L., Poucki M. H., Kiemeney L. A., & Witjes J. A. (2000), Patient opinion of urinary tests versus flexible urethrocystoscopy in follow-up examination for superficial bladder cancer: a utility analysis, Urology, 56(5), pp. 793-797.